Paolo Ruffini nasce a Livorno nel novembre del 1978. Sin da ragazzo è interessato al mondo dello spettacolo, compare in varie pubblicità e nel 1997 è un compagno di scuola del protagonista in Ovosodo di Paolo Virzì. Prima di incontrare di nuovo il cinema, incrocerà un successo di pubblico in tv, con la sua militanza a MTV dal 2002 al 2005, poi con una lunga collaborazione con Marco Giusti, specialmente per il programma Stracult, non a caso dedicato al cinema.

Sul grande schermo ricompare dal 2005, partecipando a cinepanettoni / “cinecocomeri” come Natale a Miami, Natale a New York, Natale a Rio, Un’estate ai Caraibi. Torna a lavorare con Virzì come uno dei figli di Stefania Sandrelli in La prima cosa bella (2010), ma è anche nel cast corale di Maschi contro femmine e Femmine contro maschi di Fausto Brizzi. Insieme a Paola Cortellesi e Luca Argentero si oppone ai raccomandati in C’è chi dice no (2011) di Giambattista Avellino.

Nel 2013 il suo debutto alla regia, con la commedia Fuga di cervelli, da lui anche cointerpretata, alla quale fa seguito l’anno successivo Tutto molto bello, uscito qualche mese dopo la sua conduzione dei David di Donatello e tre anni di Colorado Cafè su Italia 1. Riprende in seguito le sue partecipazioni ai film di Natale di De Laurentiis, prima con Natale col boss (2015) e nel 2016 con Natale a Londra – Dio salvi la regina: in mezzo, il comico I Babysitter, dove si riunisce ancora una volta con un suo vecchio “compagno di merende” di MTV, Francesco Mandelli.
Dal 2003 manda avanti una carriera teatrale, che comprende anche un recente one man show, il Paolo Ruffini Show.